1. Grow a culture of the strain who

1. crescer uma cultura da estirpe, cuja eficiência de acoplamento é para ser determinada a uma densidade de cerca de 1E7 células / ml em YEPD. preparar uma cultura semelhante de um tipo de tensão testador de acasalamento apropriado (pt1 = {a} ou {pt2 = alpha}).

2. misturar as células da estirpe 2E6 experimental com células 1E7 da estirpe verificadora e recolher as células em uma poro de 0,45 um com 25 mm de disco de filtro de nitrocelulose. além disso,recolher as células de cada linhagem em filtros separados (estes servem como controlos para a reversão e / ou de contaminação).

3. colocar os filtros na superfície de uma placa de YEPD (lado da célula para cima!) e incubar a 30 ° C durante 5 horas. 4. ressuspender as células em cada um dos filtros em 1 ml de caldo de y-min, sonicar durante 5-10 segundos para interromper aglomerações, e dilui-se em y-min caldo.placa as células da mistura de acasalamento em y-min média para os diplóides do título. Da mesma forma, as células da placa dos filtros de tensão única em meio sd para verificar se há reversão e / ou contaminação.calcular o rendimento de acoplamento através da determinação do título de diplóides mais as células cuja eficiência de acoplamento está a ser determinada por plaqueamento das células do filtro mistura de acasalamento em y-min suplementado com os marcadores de auxotrofia da estirpe experimental. a eficiência de acoplamento é expressa como o título de diplóides dividida pelo título de diplóides mais o título da estirpe experimental.

1. Cresce uma cultura da estirpe cuja eficiência acasalamento é estar determinado a uma densidade de cerca de 1E7 células/ml em YEPD. Preparar uma cultura semelhante de uma estirpe de testador acasalamento de tipo apropriado (PT1 {= um} ou {= alfa} de PT2).

2. Misturar 2E6 células da estirpe experimental com células 1E7 da estirpe testador e coletar as células em um poro de 0,45 µm, disco de filtro de nitrocelulose de 25 mm. Além disso recolher as células de cada estirpe em filtros separados (estes servem como controles para reversão e/ou contaminação).

3. Coloque os filtros na superfície de uma placa YEPD (célula cima!) e incube a 30 ° C para 5 hr 4. Ressuspender as células em cada filtro em 1 ml de caldo de Y-min, proceda à sonicação por 5-10 seg perturbar touceiras e diluir em caldo de Y-min. Células do acasalamento mistura na Y-min médio diplóides título da placa. Da mesma forma, células de placa no filtros única estirpe em mídia SD para verificar se há reversão e/ou contaminação. Calcular a eficiência de acasalamento por determinação do título do diplóides, além disso, as células cuja eficiência acasalamento está sendo determinada pelo chapeamento as células de acasalamento misturam filtro em Y-min suplementado com os marcadores auxotróficos da estirpe experimental. A eficiência de acasalamento é expresso como o título de diplóides dividido do título do diplóides além do título da estirpe experimental.

1. Desenvolver uma cultura da estirpe cuja eficiência é casada a ser determinada de uma densidade de 7 DIAS POR SEMANA E cerca de 1 células/ml em YEPD. Preparar uma cultura semelhantes de um adequado teste mating type strain (PT1 { =o} ou PT2 { =alfa} ) .

2. Misturar 2E6 células da linhagem experimental com a 1E7 as células da estirpe do testador e coletar as células em um dos poros de 0,45 µm, 25 mm filtro nitrocelulose disco. Além disso,Coletar células de cada estirpe em filtros separados (estes servem como controles para reversão e/ou contaminação) .

3. Coloque os filtros sobre a superfície de uma placa YEPD (células para cima!) e incubar à temperatura de 30 °C por 5 h 4. Ressuspender as células em cada filtro de 1 ml de Y-min caldo, ultrassons por 5 a 10 segundos para interromper touceiras, e diluir no Y-min caldo.As células da placa correspondente misture em Y-min médias para titulação diploides. Da mesma forma, a chapa única de células da linhagem SD filtros de média a verificar para reversão e/ou contaminação.Calcular o rendimento reprodutivo por meio da determinação do título de células diplóides plus o encosto que eficiência está sendo determinado por plaqueamento das células provenientes do acasalamento misturar filtro no Y-min complementado com os marcadores de auxotrofia experimental da cepa. A eficiência é expressa como a titulação de diplóides dividida pela titulação de diplóides plus titulação do cultivar experimental.